神經(jīng)HRP示蹤顯色液(TMB法)說(shuō)明書(shū)
上個(gè)世紀(jì) 70 年代,Kristensopn 和 Olsson 報(bào)道了HRP可神經(jīng)末梢攝取,經(jīng)軸漿逆行運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體,經(jīng)組織化學(xué)方法可顯示出神經(jīng)元的輪廓,從而開(kāi)發(fā)出 HRP 追蹤神經(jīng)元示蹤技術(shù),即為 HRP 法。3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)是非常優(yōu)越的酶免試驗(yàn)顯色劑,能
溶解于多種有機(jī)溶劑和雙蒸水中,為穩(wěn)定的無(wú)色溶液,不適量過(guò)氧化脲或雙氧水不緩沖液混 勻后,不過(guò)氧化物酶作用產(chǎn)生清晰的藍(lán)色產(chǎn)物,極易觀察,在辣根過(guò)氧化物酶的催化下 , TMB 會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色沉淀,該沉淀不溶于水和乙醇,顯色后呈藍(lán)色,可在顯微鏡下觀察。
神經(jīng) HRP 示蹤顯色液(TMB 法)是動(dòng)物經(jīng)麻醉、注入HRP后,游離或絡(luò)合型的 HRP 不氧化劑反應(yīng)生成絡(luò)合物,該絡(luò)合物氧化供氫的 TMB 顯色劑,呈藍(lán)色,在顯微鏡下清晰可見(jiàn),該檢測(cè)法較 DAB 法靈敏。該顯色液僅用于科研領(lǐng)域,不宜用于臨床診斷或其他用途。
產(chǎn)品組成 |
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50T | |
試劑(A): TMB assay buffer | 2×500ml | RT 避 光 |
試劑(B): TMB 顯色液 | 30ml | -20℃ 避 光 |
試劑(C): TMB 增強(qiáng)劑 | 2×1ml | RT |
試劑(D): TMB Wash buffer(20×) | 100ml | RT |
操作步驟(僅供參考):
1、動(dòng)物麻醉:多用(3.5%)戊巴比托妥鈉作為麻醉劑,大鼠的麻醉劑量為 0.25-0.35ml/100g。
2、導(dǎo)入HRP:有壓力注射法、電泳法以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的注射涂抹等法。
3、確定動(dòng)物存活期。
4、動(dòng)物灌注:麻醉后,經(jīng)左心室升主動(dòng)脈插管行心內(nèi)灌注固定。先用生理鹽水或 PBS 快速灌注。隨后用 4%的多聚甲醛固定液灌注,先快后慢,時(shí)間控制在 30-40min。后用 10% 蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4)。
5、取材:取組織置于 20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中,切片厚度 40μm,存于蔗糖磷酸鹽緩沖液備用。
2、配制TMB顯色工作液:取適量的TMB孵育液和TMB增強(qiáng)劑,按TMB孵育液:TMB 增強(qiáng)劑=2000~8000:1 的比例混合(具體比例應(yīng)根據(jù)具體時(shí)間摸索確定),即為TMB顯色工作液,即配即用,不宜保存。
3、配制 1×TMB Wash buffer:取適量的TMB Wash buffer(20×),按TMB Wash buffer: 蒸餾水=1:19 的比例混合,即為 1×TMB Wash buffer。室溫保存6個(gè)月有效。
4、切片用蒸餾水清洗 3 次,每次 2min。
5、切片入10ml TMB孵育液(提前 20℃溫育),避光孵育20min,其間不斷晃動(dòng)。
6、切片入10ml TMB 顯色工作液(提前 20℃溫育),避光孵育 20min,其間不斷晃動(dòng)。7、漂洗:取10ml左右的1×TMB Wash buffer 漂洗切片2-3 次,每次 5min。
8、貼片,載玻片用鉻明礬明膠包被,室溫空氣干燥。
9、脫水、透明步驟按如下操作:
①蒸餾水 10s
②70%乙醇 10s
③95%乙醇 10s
④100%乙醇 2 次,每次 10s
⑤二甲苯2次,每次 2~5min。
注意事項(xiàng):
1、如果出現(xiàn)高的反應(yīng)背景或沉淀,表明TMB底物反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈。
2、所用器皿必須潔凈,避免含有氧化劑或還原劑,否則會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
3、TMB顯色液避免反復(fù)凍融,以免顯色效率下降。
4、TMB增強(qiáng)劑注意密閉保存,否則顯色效率下降。
有效期: 12 個(gè)月內(nèi)有效。