總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒說明書
微量法
注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
研究意義:
測(cè)定對(duì)象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中常常檢測(cè)血漿、血清、唾液、尿液等各種體液,細(xì)胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。
測(cè)定原理:
在酸性環(huán)境下,還原 Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的 Fe2+-TPTZ 的能力反映了總抗氧化能力。
自備實(shí)驗(yàn)用品:
恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體 100mL×1 瓶,使用前預(yù)冷。
試劑一:液體 15mL×1 瓶,避光保存。
試劑二:液體 1.5mL×1 瓶,4℃避光保存。
試劑三:液體 1.5mL×1 瓶,避光保存。
混合液(現(xiàn)配現(xiàn)用):將試劑一、試劑二、試劑三按10:1:1的比例混合,使用前37℃預(yù)溫。
樣品的制備:
(1) 血清、血漿、唾液或尿液等液體樣品
血漿(制備時(shí)可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝,不宜使用EDTA抗凝)4℃,5000rpm 離心10min,取上清待測(cè)。血清、唾液或尿液樣品直接用于測(cè)定,也可以-80℃凍存(不宜超30d)后再測(cè)定。
(2) 組織樣品
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
(3) 細(xì)胞樣品
按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎(功率200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);10000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
操作步驟:
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至593nm,蒸餾水調(diào)零。
2、操作表
| 空白管 | 測(cè)定管 |
混合液(μL) | 180 | 180 |
樣品(μL) |
| 6 |
雙蒸水(μL) | 24 | 18 |
充分混勻,反應(yīng)10min,于微量石英比色皿/96孔板,測(cè)定593nm吸光值,△A= A測(cè)定-A空白 |
注意:空白管只需測(cè)定一次。
總抗氧化能力計(jì)算公式:
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.6308x+0.1291,R2=0.9989
(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算
總抗氧化能力(U/g)=(△A-0.1291)÷ 0.6308×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)
=53.9×(△A-0.1291)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計(jì)算
總抗氧化能力(U/mg prot)=(△A-0.1291)÷0.6308×V 反總÷(V 樣×Cpr)
=53.9×(△A-0.1291)÷Cpr
(3)按細(xì)胞計(jì)算
總抗氧化能力(U/104cell)=(△A-0.1291)÷0.6308×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))= 53.9×(△A-0.1291)÷ 細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))
(4)按液體體積計(jì)算
總抗氧化能力(U/mL)=(△A-0.1291)÷0.6308×V 反總÷V 樣= 53.9×(△A-0.1291)
V 樣總:加入提取液體積,1 mL; V 反總:反應(yīng)總體積,204μL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,
6μL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL
b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.3154x+0.1291;R2=0.9989
(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算
總抗氧化能力(U/g)=(△A-0.1291)÷0.3154×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)
=107.8×(△A-0.1291)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計(jì)算
總抗氧化能力(U/mg prot)=(△A-0.1291)÷0.3154×V 反總÷(V 樣×Cpr)
=107.8×(△A-0.1291)÷Cpr
(3) 按細(xì)胞計(jì)算
總抗氧化能力(U/104cell)=(△A-0.1291)÷0.3154×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))= 107.8×(△A-0.1291)÷ 細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))
(4)按液體體積計(jì)算
總抗氧化能力(U/mL)=(△A-0.1291)÷0.3154×V 反總÷V 樣= 107.8×(△A-0.1291)
V 樣總:加入提取液體積,1 mL; V 反總:反應(yīng)總體積,204μL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,
6μL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL