HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書
HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit
HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒
目錄號(hào):K0745
保存條件:-20℃保存。
組分說(shuō)明
Cat. No. K0745
Kit Size 100
HiFi-MMLV OneStep RT- PCR EnzymeMix 50 μl
2×OneStep RT-PCR Buffer 1.4 ml
RNase-Free Water 1 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用,請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒是專為一步法RT-PCR實(shí)驗(yàn)研制,逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行,
反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需添加試劑,無(wú)需打開管蓋,在避免污染的同時(shí)提高了檢測(cè)靈敏度和實(shí)驗(yàn)
效率。本試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動(dòng) DNA聚合酶,同時(shí)包含適用于逆轉(zhuǎn)錄和
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液和實(shí)驗(yàn)中所必需的反應(yīng)組分。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性
缺失,減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA的降解。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性強(qiáng),可獲得高產(chǎn)
量的cDNA。PCR反應(yīng)使用的快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶具有擴(kuò)增效率高、延伸速度快的優(yōu)
良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時(shí)發(fā)揮大功效。使用本試劑盒擴(kuò)增得
到的目的產(chǎn)物3′端附有一個(gè)″A″堿基,可直接用于T/A克隆。
注意事項(xiàng)
1.在操作過(guò)程中應(yīng)避免RNase污染,防止RNA降解或?qū)嶒?yàn)中的交叉污染,建議在專門
的區(qū)域進(jìn)行RNA操作,使用專門的儀器和耗材,操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)
常更換手套。
2.實(shí)驗(yàn)盡量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,應(yīng)使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙
酯)水溶液在37℃處理12小時(shí),并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用,或者將玻璃
器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實(shí)驗(yàn)中用到的無(wú)菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC
處理后進(jìn)行高壓滅菌。
3.本試劑盒中的所有試劑使用前請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻,盡量避免起泡,并經(jīng)短暫離心
后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃,避免反復(fù)凍融。
4.本試劑盒必須使用特異性引物,引物的選擇可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇,引物設(shè)計(jì)的好
壞直接影響到RT-PCR 反應(yīng)的結(jié)果,設(shè)計(jì)引物時(shí)需考慮GC含量,引物長(zhǎng)度,引物
位置,PCR產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素,建議采用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件來(lái)設(shè)計(jì)。
使用方法
1.將RNA模板、引物、 OneStep RT-PCR Buffer、OneStep RT-PCR EnzymeMix
和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
2.根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系:
試劑 25 μl反應(yīng)體系 終濃度
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μl 1×
Forward Primer,10 µM 1 μl 0.4 μM
Reverse Primer,10 µM 1 μl 0.4 μM
HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix 0.5 μl
RNA Template X μl 10 pg –1 µg
RNase-Free water up to 25 μl
注意:引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí),可降低引物濃度,由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
3.渦旋震蕩混勻,短暫離心,將溶液收集到管底。
4.將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45℃,將PCR管置于熱循環(huán)儀中,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
反應(yīng)條件:
步驟 溫度 時(shí)間
反轉(zhuǎn)錄 45℃ 30 min
PCR預(yù)變性 95℃ 2 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個(gè)循環(huán)
延伸 72℃ 30 s
終延伸 72℃ 5 min
注意:1)一般PCR實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時(shí)間一般為20-30秒,無(wú)法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí),適當(dāng)降低退火溫度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí),提高退火溫度,由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
2)延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增的片段大小設(shè)定,本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴(kuò)增效率為1 kb/30s。
3)可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少,擴(kuò)增量不足;循環(huán)次數(shù)多,錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加,非特異性背景嚴(yán)重。所以,在保證產(chǎn)物得率的前提下,應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
5.反應(yīng)結(jié)束后取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物,加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測(cè)結(jié)果。
相關(guān)產(chǎn)品信息
目錄號(hào) 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品特點(diǎn)
YJ0580 TRIzon總RNA提取試劑 適用范圍廣的RNA提取試劑
YJ0581 超純RNA提取試劑盒
兼具有適用范圍廣和純度高特點(diǎn)的RNA提取試劑
K0597 超純RNA提取試劑盒(含DnaseI) 靈敏度高,可識(shí)別pg級(jí)別的模板。與RNA親和力強(qiáng),
K0741 SuperRT cDNA第--鏈合成試劑盒能夠通讀GC含量高,二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板。
K0744 HiFi-MMLV cDNA第--鏈合成試劑盒高效獲得cDNA產(chǎn)物
SuperQuickRT cDNA第--鏈合成試逆轉(zhuǎn)錄(針對(duì)于熒光定量PCR試劑盒(For Real-time PCR))
K2381 僅需15分鐘,即可完成熒光定量PCR所需的cDNA
SuperQuickRT MasterMix 即用型逆轉(zhuǎn)錄mix,只需加入RNA和水即可反應(yīng)。僅
K2391 (for Real-Time PCR) 需15分鐘,即可完成熒光定量PCR所需的cDNA
K0688 Es Taq DNA Polymerase 兼具高擴(kuò)增效率和高保真性的PCR產(chǎn)品
K0690 Es Taq MasterMix
K0957 UltraSYBR Mixture 熒光定量PCR—SYBR Green法
K0956 UltraSYBR Mixture(With ROX) 特異性強(qiáng)、Ct值低、定量更準(zhǔn)確