Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說明書
Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit
目錄號(hào):K2576
保存:2-8 ℃避光保存
組分說明
Cat.No. K2576
KitSize 50
4×BindingBuffer 10ml
PropidiumIodide,PI 500 μl
AnnexinV-AlexaFluor488 250 μl
產(chǎn)品簡介
AnnexinV-AlexaFluor488/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒是一種采用AnnexinV-AlexaFluor488 與PI 雙染法進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡分析的檢測(cè)試劑盒。
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面,這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面,在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。AnnexinV 具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性,對(duì)PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的,也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的,而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細(xì)胞非透過性熒光染料碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)不能通過完整的活細(xì)胞,但能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募?xì)胞進(jìn)行染色,因此通常將AnnexinV 與 PI 配合染色,以區(qū)別凋亡早期細(xì)胞與壞死細(xì)胞和凋亡的晚期細(xì)胞。
注意事項(xiàng)
1. 消化細(xì)胞時(shí)不能用含EDTA 的胰酶。
2. 本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
3. 需自備PBS 和去離子水。
4. 熒光染料均存在淬滅問題,保存和使用過程中請(qǐng)盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。
5. PI 對(duì)人體有刺激性,請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。
6. 請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
操作步驟
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:
a. 對(duì)于貼壁細(xì)胞:小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用胰酶消化細(xì)胞,至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí),加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打下所有的貼壁細(xì)胞,并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g 左右離心3-5 分鐘,沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞沉淀不充分,可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50μl 左右的培養(yǎng)液,以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清。再次加入1ml4℃預(yù)冷的PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞。
b. 對(duì)于懸浮細(xì)胞:1000×g 左右離心3-5 分鐘,沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞沉淀不充分,可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50 微升左右的培養(yǎng)液,以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS,重懸細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清,可以殘留約 50μl 左右的 PBS,以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml4℃預(yù)冷的PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞。
2. 用去離子水按 1:4 稀釋BindingBuffer(4mlBindingBuffer+12ml 去離子水);
3. 用 250μlBindingBuffer 重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/ml;
4. 取100μl 的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中,加入5μlAnnexinV-AlexaFluor488 和 10 μl20μg/ml 的 PI 溶液;
5. 混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘;
6. 在反應(yīng)管中加 400μlPBS,流式細(xì)胞儀(FACS)分析。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目
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| 染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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