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        羊痘病毒(GaPV)核酸檢測試劑(熒光PCR法,外源內(nèi)標)
        點擊次數(shù):243 更新時間:2024-08-07

        羊痘病毒(GaPV)核酸檢測試劑(熒光PCR法,外源內(nèi)標


         

        包裝規(guī)格:48 T/

        產(chǎn)品說明:

        采用Taqman探針技術(shù),以羊痘病毒(GaPV,羊痘病毒屬包含綿羊痘病毒、山羊痘病毒和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒等3種病毒)特異性保守基因為靶位點設(shè)計特異性引物和探針,用于樣品中GaPV核酸的輔助檢測。本產(chǎn)品引入了dUTP / UDG 系統(tǒng),可降解含UssDNAdsDNA,消除由PCR產(chǎn)物導(dǎo)致的交叉污染。 同時設(shè)置陽性內(nèi)對照 (即內(nèi)標,使用VIC報告基團),通過檢測內(nèi)標是否正常來監(jiān)測qPCR體系中是否含有 PCR抑制物,避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

        產(chǎn)品組成:


        組分名稱

        主要成分

        DV231Y-21-V1

        1

        GaPV PreMix-2

        qPCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、UDG酶、Taq酶、引物、探針

        960  μL/

        2

        GaPV陰性對照-2

        無酶水

        400  μL/

        3

        GaPV內(nèi)標對照-2

        含內(nèi)標擴增片段的核酸

        480  μL/

        4

        GaPV陽性對照-2

        含目標擴增片段的核酸

        50  μL/

        注:不同批號產(chǎn)品的成分之間不可以混用或互換?。?!

        儲存條件和保質(zhì)期:

        -20±5避光儲存,有效期12月。干冰運輸。重復(fù)凍融小于5次。生產(chǎn)日期,失效日期請見外包裝盒。

        適用儀器:

        ABI7500宏石96P、Bio-Rad CFX96實時熒光PCR儀等。

        樣品要求:

        1、適用樣品類型

        活體或剖檢牛羊的皮膚丘疹、肺部病變組織、淋巴結(jié)、血液等樣品

        要求送檢新鮮樣品,禁止反復(fù)凍融!

        2、樣品處理(核酸提取區(qū))

        參照NY/T 541-2016 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范》等標準進行樣品前處理, 使用商業(yè)化的提取試劑盒提取樣品中的核酸。提取時,每200 μL陰性對照處理后的樣品溶液中添加10 μL內(nèi)標對照,提取后的核酸應(yīng)立即檢測,否則凍存于-20±5,保存時間不超過6個月,禁止反復(fù)凍融!

        *內(nèi)標對照的其它使用方:將內(nèi)標對照混入 qPCR工作液中,但僅僅質(zhì)控擴增過程和監(jiān)測qPCR體系中是否含有 PCR抑制物,不能質(zhì)控提取核酸過程。

        檢測方法

        為了防止污染,實驗需分區(qū)操作?。?!

        注:核酸提取參照樣品要求,在核酸提取區(qū)進行或在樣品處理區(qū)進行。

        1、試劑準備 (在試劑準備區(qū)進行)

        (1) 推薦方式(內(nèi)標對照質(zhì)控核酸提取和核酸擴增過程)

        取出試劑盒中的各組分以及自備試劑,室溫放置,待溫度平衡至室溫,混勻后備用;

        根據(jù)檢測樣品數(shù)量,建議每次檢測均設(shè)置陰性對照和陽性對照。將所需數(shù)量(N)的GaPV PreMix-2分配到每個微離心管(如八連管)中,20 μL/管。待檢樣品數(shù)為n時,所需反應(yīng)數(shù)N=樣品數(shù)(n)+陽性對照(1)+陰性對照(1)

        當準備使用時,再轉(zhuǎn)移到樣品處理區(qū)。

        (2) 其它方式內(nèi)標對照僅質(zhì)控核酸擴增過程

        根據(jù)所檢測的樣品數(shù)量按照下表配制反應(yīng)液,建議每次檢測均設(shè)置陰性對照和陽性對照。待檢樣品數(shù)為n時, 需配制反應(yīng)體系數(shù)N=待檢樣品數(shù)(n) +陽性對照(1)+陰性對照(1)+1。

        *qPCR工作液配制表(其它方式)

        組份

        每反應(yīng)體積(μL)

        GaPV PreMix-2

        20 μL×N

        GaPV內(nèi)標對照-2

        0.5 μL×N

        *注:本配制方法為在提取樣品核酸未加內(nèi)標對照時的補救方法,不推薦。

        將配制好的qPCR工作液充分混勻后瞬時離心,待用;當準備使用時,將等量的20 μL分配到每個微離心管(如八連管)中,并轉(zhuǎn)移到樣品處理區(qū)。

        2、樣品加樣 (在樣品處理區(qū)進行)

         在每個PCR管中加入5 μL經(jīng)提取的待測樣品和陰性對照、陽性對照,蓋上管蓋, 瞬時離心,使液體全部沉于管底。

        3、qPCR擴增 (在擴增與分析區(qū)進行)

         (1) 熒光通道選擇

        熒光基團選擇FAM通道檢測GaPV;選擇VIC 通道檢測內(nèi)標;淬滅基團設(shè)置為none。如ABI qPCR儀,還需設(shè)置Passive Referencenone。其它儀器參考儀器說明書。

        (2) qPCR擴增程序設(shè)置

        設(shè)置反應(yīng)體系為25 μL。

         

        步驟

        溫度

        反應(yīng)時間

        循環(huán)

        UDG消化

        50

        5 min

        1

        預(yù)變性

        95

        30 sec

        1

        擴增

        變性

        95

        5 sec

        45

        退火與延伸

        60

        35 sec,數(shù)據(jù)收集

        4、結(jié)果分析 (ABI7500 qPCR儀為例)

        反應(yīng)結(jié)束后,qPCR儀將自動生成結(jié)果。若儀器自動生成的擴增曲線或閾值線有異常,用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整,基線Start值可以在 3~10,基線End值可設(shè)在 5~20,調(diào)整各擴增曲線的基線區(qū)相對水平即可。點擊Analyze 進行分析。

        5、質(zhì)量控制

        試劑盒中各控制項應(yīng)符合下列要求,否則實驗無效。


        陽性對照

        陰性對照

        FAM通道GaPV

        Ct32

        Ct值或Ct>40

        VIC通道

        (內(nèi)標)

        Ct值或Ct>40

        典型的S形曲線,Ct35

        參考qPCR工作液配制表(其它方式)配制時,陽性對照的VIC通道應(yīng)出現(xiàn)S型曲線,Ct35。

        檢驗結(jié)果的解釋

        (1)若樣品的VIC通道呈典型的S形曲線且Ct35時,

        A. FAM通道Ct35,判定為GaPV陽性

        B. FAM通道Ct值在3540之間時,需要觀察靶基因的擴增曲線是否呈S形,如果曲線呈S形,樣品應(yīng)視為疑似GaPV陽性,需重新檢測;復(fù)測結(jié)果若Ct值≦40且具有典型S形曲線,判定為GaPV陽性;反之若為無Ct顯示、Ct>40或無典型S形曲線,則判定為GaPV陰性。

        C. FAM通道Ct>40,判定為GaPV陰性

        2)如果VIC通道的Ct值高于35,而沒有顯示明顯的S形擴增曲線,原因如下:

        1) 樣品中存在PCR抑制劑,建議實驗前稀釋模板。

        2) 核酸提取操作存在缺陷,建議重復(fù)核酸提取進行檢測。

        3) 在處理過程中沒有獲得合格的樣品,或者在運輸和儲存過程中樣品已經(jīng)降解,建議重新采樣。

        檢驗方法的局限性

        1) 陰性結(jié)果可能是由于從樣品中提取的核酸質(zhì)量低,儲存條件不當,儲存期不合適,樣品中存在抑制劑,核酸降解和核酸提取方法的提取效率差等原因。

        2) 不合理的樣品采集、運送與保存條件,樣品中病毒含量過低,或不合理的實驗操作和環(huán)境很可能造成假陰性或假陽性結(jié)果。其它臨床觀察和相關(guān)資料應(yīng)結(jié)合測定,必要時再次進行檢測。

        3) 由于突變或其它原因,靶序列的序列變化可能會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

        注意事項:

        1) 本產(chǎn)品僅用于科研使用,使用前請仔細閱讀本說明書。

        2) 實驗前請熟悉和掌握需使用的各種儀器的操作方法和注意事項,對每次實驗進行質(zhì)量控制。

        3) 實驗室管理需嚴格遵照PCR基因擴增實驗室的管理規(guī)范,實驗人員必須進行專業(yè)培訓(xùn),實驗過程嚴格分區(qū)進行, 所有消耗品僅作一次性使用,實驗操作的每個階段使用專用儀器和設(shè)備,各區(qū)各階段用品不可交叉使用。

        4) 所有檢測樣品均視為具有傳染性的物質(zhì),實驗過程中穿工作服并經(jīng)常更換手套,以避免樣品間的交叉污染;

        5) 樣品操作、廢棄物處理應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)要求:《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準則》和《醫(yī)療廢物管理 條例》。

        6) 所有試劑 (包括本產(chǎn)品中的組分與客戶自備試劑) 使用前均需徹底化凍、混勻。

        7) 液類樣品溶血嚴重時,會使擴增曲線高度顯著下降。因此,當使用該試劑盒同時檢測血樣品原液和生理鹽水稀釋 樣品時,建議對2類模板分別設(shè)置不同的閾值線,以保證結(jié)果的準確性。

        8) 當出現(xiàn)多個樣品的Ct>40時,可能是qPCR儀自動生成的閾值線較高的原因,建議將閾值線高度設(shè)置在擴增曲線 最大熒光值的1/15左右后,重新分析。

        本產(chǎn)品僅供科研使用,檢測結(jié)果不能用作臨床診斷判斷唯一依據(jù)

        2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實驗服務(wù)及論文潤色十多年,是您值得信賴的科研合作伙伴!

        如果您受時間、試驗條件等限制而無法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

         

        實驗技術(shù)服務(wù):

         


        滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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