甲硝唑酶聯(lián)免疫試劑盒說明書 |
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甲硝唑酶聯(lián)免疫試劑盒 說明書 一、藥物概述及檢測(cè)原理 甲硝唑抗菌藥,主要用于治療和預(yù)防滴蟲、阿米巴原蟲及厭氧菌引起的感染。 本公司的甲硝唑酶聯(lián)免疫試劑盒使用xing生物技術(shù)開發(fā),具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)。 本試劑盒利用甲硝唑抗體與甲硝唑可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì),先在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗原,再加入標(biāo)準(zhǔn)品(樣本)和甲硝唑抗體,樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的甲硝唑藥物與固定在酶標(biāo)板上的抗原競(jìng)爭(zhēng)甲硝唑抗體,再加入酶標(biāo)記二抗反應(yīng),hou加入底物催化顯色。此時(shí)顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)品(樣本)中甲硝唑藥物的含量成反比。 二、試劑盒內(nèi)包含組分: 標(biāo)準(zhǔn)品工作液:0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb,1 mL/瓶。 96孔酶標(biāo)板:1塊 甲硝唑抗體工作液:1瓶(7mL/瓶) 酶標(biāo)Ⅱ抗工作液:1瓶(12 mL/瓶) 20×濃縮洗滌液:1瓶(30 mL/瓶) 組織樣品處理液Ⅰ:1瓶(干粉,選配,如有需求請(qǐng)向廠家索取) 牛奶樣本處理液:1瓶(10ml/瓶,選配,如有需求請(qǐng)向廠家索取) 復(fù)溶工作液:1瓶(50 mL/瓶) 底物A液:1瓶(7mL/瓶) 底物B液:1瓶(7 mL/瓶) 終止液:1瓶(7mL) 說明書 蓋板膜 自封袋 三、用戶需要自備的設(shè)備和試劑 儀器: 酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm、630 nm) 電子天平(精度:0.01 g) 離心機(jī)(3000 g及以上) 生化培養(yǎng)箱(可調(diào)4℃,25℃) 搖床 旋渦振蕩器 氮吹儀 微量移液器:(20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍) 計(jì)時(shí)器 試劑:(試劑均為分析純) 乙酸乙酯 正己烷 氫氧化鈉 濃鹽酸 四、試劑盒特異性 試劑盒與其他甲硝唑藥物的交叉反應(yīng)率: v 甲硝唑…………………………………100% 五、樣本檢測(cè)步驟 1. 1工作液準(zhǔn)備 v 組織樣品處理液Ⅰ:將粉末藥品溶于200ml去離子水即得(如有需求請(qǐng)向廠家索取)。 v 組織樣品處理液Ⅱ:準(zhǔn)確量取400 mL乙酸乙酯和100 mL正己烷,充分混勻后待用。 v 洗滌工作液:取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。 v 0.1M NaOH:稱取0.8 g NaOH,加入200 mL去離子水溶解。 v 1M HCL:量取1ml濃鹽酸,加入11mL去離子水溶解混勻。 2. 2樣品前處理 組織(雞肉、豬肉)(稀釋倍數(shù):0.5) Ø 精確稱取2 g均質(zhì)后的組織樣品于50 mL塑料離心管中; Ø 加入2 mL組織樣品處理液Ⅰ(見5.1),強(qiáng)烈震搖1min (或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s)以使處理液Ⅰ與樣本充分接觸; Ø 加入8 mL組織樣品處理液Ⅱ(見5.1),充分震搖(或渦動(dòng))3 min(注:若實(shí)驗(yàn)室配置有搖床,可充分震搖1min后使用搖床300rpm 25℃震搖10分鐘); Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min; Ø 取4 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中; Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑; Ø 加入2 mL正己烷,再加入0.5 mL復(fù)溶工作液,強(qiáng)烈震搖1min(或渦動(dòng)30 s); Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上,離心5 min; Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層(注:批量檢測(cè)樣本時(shí)使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷); Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。 蜂蜜(稀釋倍數(shù):0.5) Ø 稱取2.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml塑料離心管中; Ø 加入2ml 0.1M 氫氧化鈉溶液(見5.1),強(qiáng)烈震搖使蜂蜜溶解; Ø 加入4ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min(或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)3min)使樣本與有機(jī)相充分接觸; Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min; Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意:不要取到下層水相),使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑; Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液,強(qiáng)烈震搖2min(或渦動(dòng)1min); Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。 原奶方法一(稀釋倍數(shù):5) Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上; Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層,小心取出1ml樣本加入2ml離心管中(注意:盡量不要取到上層的奶油); Ø 加入50μL 1M鹽酸(見5.1),強(qiáng)烈震搖1min (或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s); v 使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min; Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中(注意:盡量不要取到上層的奶油),再加入400μL復(fù)溶工作液,強(qiáng)烈震搖1min (或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s); Ø 取50 μL液體進(jìn)行分析。 原奶方法二(稀釋倍數(shù):1) Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上; Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層,小心取出2ml樣本加入50ml離心管中(注意:盡量不要取到上層的奶油); Ø 加入100μL 牛奶樣本處理液,再加入6ml乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min (或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)1min); Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min; Ø 取1.5 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中; Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑; Ø 加入1 mL正己烷,再加入0.5 mL復(fù)溶工作液,強(qiáng)烈震搖1min(或渦動(dòng)30 s); Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上,離心5 min; Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層(注:批量檢測(cè)樣本時(shí)使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷); Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。 生蛋方法一(稀釋倍數(shù):1) Ø 量取1ml全蛋樣本至50ml塑料離心管中; Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液(見5.1),8ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min(或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)3min)使樣本與有機(jī)相充分接觸; Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min; Ø 移取4ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意:不要取到下層水相),使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑; Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液,1ml正己烷,強(qiáng)烈震搖2min(或渦動(dòng)1min),離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min; Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層(注:批量檢測(cè)樣本時(shí)使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷); Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。 生蛋方法二(稀釋倍數(shù):5) Ø 取出1ml樣本加入2ml離心管中; Ø 加入100μL 1M鹽酸(見5.1),強(qiáng)烈震搖1min (或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s); Ø 使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min; Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中,再加入400μL復(fù)溶工作液,強(qiáng)烈震搖1min (或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s); Ø 取50 μL液體進(jìn)行分析。 熟蛋(稀釋倍數(shù):2) Ø 稱取1g熟蛋樣本至50ml塑料離心管中; Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液(見5.1),8ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min(或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)3min)使樣本與有機(jī)相充分接觸; Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min; Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意:不要取到下層水相),使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑; Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液,1ml正己烷,強(qiáng)烈震搖2min(或渦動(dòng)1min),離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min; Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層(注:批量檢測(cè)樣本時(shí)使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷); Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。 3. 3檢測(cè) 準(zhǔn)備:將要使用的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上,并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置,為減小檢測(cè)值波動(dòng)建議做雙孔平行實(shí)驗(yàn)(每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)兩孔),未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后,保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì); 加樣:向?qū)?yīng)微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液50 μL,再向每孔中加入50 μL抗體工作液; 孵育:輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s,使孔內(nèi)液體充分混勻后,蓋好蓋板膜于4℃避光反應(yīng)60 min; 洗滌:取出酶標(biāo)板后小心揭開蓋板膜,倒出板孔中液體后,在每孔加 250 μL洗滌工作液,浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液,然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后,將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上,用力拍干; 加酶:在每孔中加入100 μL酶標(biāo)Ⅱ抗工作液(洗滌后的酶標(biāo)板在加酶前不宜在室溫環(huán)境過長(zhǎng)時(shí)間放置,以防微孔干燥導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異); 孵育:輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s,蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)20min; 洗滌:按照前面敘述的方法再次洗滌酶標(biāo)板; 顯色:在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液(注:底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合,混合液在10 min內(nèi)使用,切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效); 孵育:輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s,使孔內(nèi)液體充分混勻后,蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min; 終止:在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔,底物液由藍(lán)變黃表明終止成功。 讀數(shù):終止后的酶標(biāo)板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù),建議使用450 nm、630 nm雙波長(zhǎng)讀取酶標(biāo)板吸光度值。 4計(jì)算結(jié)果 設(shè)各標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)的吸光度平均值為B,零標(biāo)準(zhǔn)(濃度為0 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品)吸光度平均值B0以(B/B0)×100%為各標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比: 使用半對(duì)數(shù)系統(tǒng)代入標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比,與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,即可得出樣品對(duì)應(yīng)的濃度,后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中檢測(cè)物含量。 六、試劑盒參數(shù) Ø 試劑盒靈敏度:0.1 ppb; Ø 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍:0.1 ppb-8.1 ppb; Ø 板內(nèi)變異系數(shù):<5%; Ø 板間變異系數(shù):<15%; Ø B0吸光度jia值:>0.8; Ø 回收率:90%±30% Ø 樣品低檢測(cè)限: 豬肉、雞肉…………………………………………約0.5 ppb 蜂蜜…………………………………………………約0.1 ppb 原奶方法一…………………………………………約1 ppb 原奶方法二…………………………………………約0.2ppb 生蛋方法一…………………………………………約0.5 ppb 生蛋方法二…………………………………………約1.5 ppb 熟蛋……………………………………v……………約1 ppb 注:ppb=ng/mL或ng/g。 七、分析限制 本試劑盒為定量或半定量試劑盒,建議用于大量樣本篩查分析。若檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,建議使用儀器方法開展確證實(shí)驗(yàn)(如GC/MS、LC-MS/MS等)。 八、試劑盒貯存條件及有效期 Ø 試劑盒貯存在2-8℃有效期為一年,切勿凍存。 Ø 未使用完的酶標(biāo)板條須密封保存2-8℃的環(huán)境中。 九、注意事項(xiàng) Ø 使用試劑盒前,請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)閱讀說明書。 Ø 試劑盒使用前,需將盒內(nèi)各組份置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上回溫至室溫(25±2℃)(提示:約1 h)。 Ø 試劑在使用前許搖勻,混合時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。 Ø 槍頭為一次性用品,為防止試劑交叉污染,檢測(cè)過程中所用槍頭不得重復(fù)使用。 Ø 請(qǐng)勿使用過期試劑盒,不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用。 Ø 樣品處理完畢后請(qǐng)立即分析,否則可能影響檢測(cè)結(jié)果。 Ø 底物A液、底物B液均為無(wú)色透明液體,若在使用前已變成藍(lán)色,或混合后立即變藍(lán),說明試劑已污染或變質(zhì)。 Ø 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速,以免反應(yīng)時(shí)間差對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。 Ø 終止液中含有硫酸,若不小心濺上皮膚或衣物請(qǐng)立即用大量清水沖洗。若不shen入眼,請(qǐng)?jiān)?清洗后去醫(yī)院檢查。 |