一、孔雀石綠快速檢測試劑盒原理

本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物孔雀石綠將和 微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體， 加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值 與其所含殘留物孔雀石綠的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn) 曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物孔雀石綠的含量。

二、孔雀石綠快速檢測試劑盒特性

試劑盒靈敏度：  0.05ppb

孵育溫度：    25℃

孵育時間：    30min～30min～15min

樣本檢測限

水樣 ———————— 0.1ppb

水產(chǎn)品 ·——————+—— 0.5ppb

• 交叉反應(yīng)率

• 樣本回收率

水樣、水產(chǎn)品 ————————  80%~110%

• 精密度

板內(nèi)、板間變異系數(shù)≤12%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、 刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮 吹儀、恒溫箱微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl

試 劑：乙腈、二氯甲烷、無水硫酸鈉、正己烷

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試 劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈， 必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實 驗結(jié)果。

 樣本前處理需配制： 配液 1 樣品提取液乙腈-二氯甲烷混合溶液：

V 乙腈-V 二氯甲烷 = 4 : 1，取 40ml 乙腈， 再加入 10ml 二氯甲烷，混勻后使用。

配液 2 樣品復(fù)溶液

將 4X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：3 稀釋 （1 份 4×濃縮復(fù)溶液+3 份去離子水），或按所需用 量配制。

 樣本處理：

（a）水樣處理方法

取 50µl 清澈水樣樣直接測定（如果水樣渾濁 一定要過濾或 4000r/min 離心 10min，直至得到 清澈樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

（b）水產(chǎn)品處理方法

1、稱取 2±0.05g 均質(zhì)組織樣品于 50ml 離心管中， 加入 6ml 樣品提取液（配液 1），2g 無水硫酸 鈉，振蕩 5min ，室溫（25℃左右）4000r/min以上離心 10min；

2、取 3ml 上清液，加入 20µl 氧化劑，搖勻，在 56℃ 條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；

3、加入 1ml 正己烷，加入 1ml 樣品復(fù)溶液（配液2），振蕩搖勻 1min，4000r/min 以上離心 5min；

4、取下層 50 µl 用于分析；

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

注：此方法所得到的結(jié)果為孔雀石綠；隱性孔 雀石綠；結(jié)晶紫；隱性結(jié)晶紫的總量。

六、酶標(biāo)免疫分析程序:

測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 （20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜 蓋住微孔板。

操作步驟：

1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～ 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使 用前均須搖勻。

2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放 入自封袋，保存于 2-8℃。

3、配液 1：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去 離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份 去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液 2：

配制孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液：取一定量的 10 倍濃縮

標(biāo)準(zhǔn)液用樣品復(fù)溶液 10 倍稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用， 具體如下：

標(biāo)準(zhǔn)液6：配制4.05ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 40.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液5：配制1.35ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 13.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液 4：配制 0.45ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取 50ul 4.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液 3：配制 0.15ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取 50ul 1.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液 2：配制 0.05ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取 50ul 0.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液 1：配制 0ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取 50ul 0ppb 標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻；

4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每 個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和 樣本孔所在的位置。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加 入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振 蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。

6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔 洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙 拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺 破）。

7、每孔加入酶標(biāo)記物 100µl，蓋板膜蓋板后置25℃ 環(huán)境中反應(yīng) 30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌 液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍 干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯 色 15min。

9、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè) 定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方 法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與 其所含孔雀石綠量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出 其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3， 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：

0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816；0.15ppb 為 1.415； 變質(zhì)。

0.45ppb 為 0.74；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155。  8、該試劑盒佳反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應(yīng)的稀 釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分 吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙 孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘 以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100% B0

低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。 2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見

包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正 常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀 釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于 大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項

1、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會 伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜 使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用 不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴 露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo) 準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能